前言
人GnRH受体(hGnRHR)是促性腺细胞表面存在的7个跨膜G蛋白相耦联的受体。在与hGnRHR结合时,下丘脑的十肽GnRH刺激垂体前叶的基因表达,合成和释放促性腺激素-LH和FSH。,配体对hGnRHR的刺激通过磷脂酶C(PLC)的增加,引起信号发放,导致细胞内外钙源的动员,激活PKC和MAPK通路。蛋白激酶A(PKA)/cAMP通路可能也被GnRH激活。虽然通常使用GnRH经PLC激活引起肌醇磷酸生成来评价对GnRH的信号转导反应,但不清楚这个通道的激活与促性腺激素亚单位的刺激和GnRHR基因的表达是否有关。控制基因转录的GnRH刺激确切机制也尚未确定。
因为GnRH在调节生殖功能中的重要作用,所以在特发性促性腺激素不足性腺机能减退病人筛查hGnRHR的突变。结果,鉴别出了许多与生殖功能异常相关的自然出现的hGnRHR基因突变。在体外,这些hGnRHR突变的功能分析表明,改变了细胞表达水平、配体结合,和/或信号转导。在部分IHH病人最早鉴别出了两种普遍自然出现的hGnRHR突变,它们分别为,第一次细胞外环中在106位置上(Gln106Arg)谷氨酰胺被精氨酸取代和第三次细胞内环中在262位置(Arg262Gln)上精氨酸被谷氨酰胺取代。这两种hGnRHRs突变的功能分析显示,Gln106Arg突变显著减少了GnRH的结合,而Arg262Gln对体内受体亲和力影响很小。有趣的是,两种突变引起类似的PLC激活,表现为对GnRH的细胞内IP生成减少反应。后来,在几名不同表型的IHH病人发现,Gln106Arg和Arg262Gln突变以混合杂合性同时出现或结合其它hGnRHR突变存在。最近,在一名男性无睾综合症病人和一名女性部分IHH病人发现了纯合Gln106Arg突变。
要更好地了解存在Gln106Arg和/或Arg262Gln突变病人的表型和基因型之间的关系,重要的是确定突变受体与GnRH结合下游的功能和IP产物。特别是突变受体对GnRH所产生的促性腺激素亚单位和GnRHR基因表达反应的影响有重要的病理学意义。此外,部分失活的hGnRHR突变-Gln106Arg和Arg262Gln,是研究GnRH调节促性腺激素亚单位和GnRHR基因表达中的信号转导通路的有用工具。
本研究在体外分析了Gln106Arg 和 Arg262Gln对GnRH刺激的促性腺激素亚单位和GnRHR基因启动子激活的影响。尽管这两种突变受体引起类似的对GnRH的IP反应减小,但对GnRH刺激的促性腺激素亚单位和GnRHR基因表达有不同的影响。因此,也研究了突变受体对其它信号转导通路的影响,以确定两种突变导致不同效应的机制。
材料与方法
细胞培养
所有培养试剂由Life Technologies Inc获得。在低葡萄糖DMEM中培养COS-7和GH3细胞。在37℃下5% CO2的潮湿空气中,孵化细胞。
定点诱变
使用定点诱变,将Gln106Arg 或 Arg262Gln引入Dr. Thomas Gudermann所提供的编码野生型hGnRHR表达载体。在Gln106Arg hGnRHR突变中,使用引物对:sense, 5'-GTGGACATTACAGTCCGATGGTATGCTGGAGAG-3',和 antisense, 5'-CTCTCCAGCATACCATCGGACTGTAATGTTCCA C-3',在hGnRHR核苷酸372位置上,Gln 密码子 CAA 被Arg 密码子 CGA所替代。在Arg262Gln hGnRHR突变中,使用引物对: sense, 5'-CAATATACCAAGAGCACAGCTGAAGACTCTAAAAATGACG-3',和antisense, 5'-CGTCATTTTTAGAGTCTTCAGCTGTGCTCTTGGTATATTG-3',在hGnRHR 840位置上Arg密码子 CGG 被 Gln 密码子 CAG替代。使用QuikChange 定点诱变药盒产生hGnRHR突变,所插入的突变由双向测序证实。
免疫细胞化学
COS-7细胞涂于35mm的玻璃培养皿中,使用GenePorter转染试剂(野生型, Gln106Arg,或Arg262Gln),或对照表达载体(pcDNA3),进行瞬时脂质体转染。在37℃下孵育48小时后,以冰冻PBS洗涤细胞,在室温下以新鲜的4%甲醛溶液固定30分钟,以PBS洗涤两次,在室温下以PBS/1%BSA闭锁30分钟。在37℃下以5ug/ml抗(HA)荧光剂抗体整夜孵化细胞,并以PBS洗涤4次。使用共焦激光显微镜在x40油浸接物镜下检测细胞完整表面上的野生型和突变型hGnRHRs。
受体结合测定
COS-7细
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